三阴性乳腺癌(TNBC)占所有乳腺癌(BC)患者的15%，是一种与预后不良相关的异质性肿瘤。在所有BC亚型中，TNBC显示出最高数量的肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，这表明TNBC可以受益于免疫检查点封锁(ICB)。近年来以免疫检查点抑制剂（ICB）为代表的免疫治疗药物在多种肿瘤的治疗中取得了巨大成功，大大提升了部分肿瘤病人的生存率和生活质量，而ICB单药的新辅助治疗将很快成为BC治疗护理标准的一部分。
近日，比利时鲁汶大学DietherLambrechts等研究人员应用scRNA-seq,scTCR-seq和CITE-seq方法分析了免疫治疗前后肿瘤微环境内细胞组分的变化，从而鉴定出对免疫治疗有潜在贡献的特定细胞类型，特别是与T细胞克隆增殖相关联的细胞亚群。相关论文于年5月6日发表于NatureMedicine。
1.抗PD1治疗前和治疗后的单细胞分析
SINGLE-CELLPROFILINGBEFOREANDDURINGANTI-PD1TREATMENT
首先，作者进行了一项涉及早期诊断的BC的“机会窗口”研究（BioKey，NCT），在手术前大约9±2天，一组患有非转移性、未经治疗的原发性乳腺浸润性癌患者接受了一剂派姆单抗（Keytruda或抗PD1）治疗（图1a）；对29例初诊患者，抗PD1治疗前后进行scRNA-seq和scTCR-seq，共获得,个高质量细胞，平均每个细胞检测9个基因，降维聚类后得到恶性乳腺上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞几种主要细胞类群（图1b）；使用scTCR-seq在51,个T细胞中定义了基于共享TCR序列的克隆型，在设定的共享序列细胞数大于2和大于5的两个阈值中，发现9个患者在治疗前后有明显的克隆扩增（图1c）；将有克隆扩增和无克隆扩增的患者分别定义为Es和NEs，比较发现，NEs中成纤维细胞较多，Es中T细胞较多（图1d）；单独对T细胞聚类，发现CD8+及CD4+亚群表达PD1（图1e,f）；同时还检测到第三个由高增殖T细胞组成的PD1+亚群，它们的相对丰度在处理前和处理后均较高，但在处理后增加（图1g）；TEX亚群在Es中克隆扩增能力显著增强（图1h），而且处理前后，Es的克隆型丰富度低于NEs（图1i）；使用CITE-seq确认来自Es的预处理T细胞中PD1表达增加（图1j）。
图1通过scRNA-seq进行细胞和T细胞表型的BioKey研究设计和注释
AnalyticalBioSciences
●●●
2.T细胞沿着CD8+TEX细胞，CD4+TH1和TFH克隆扩增
TCELLEXPANSIONALONGTHECD8+TEXCELL,CD4+TH1ANDTFHCELLTRAJECTORY
作者对CD8+T细胞进行发育轨迹分析，发现存在3个不同的分化方向（图2a）；包括TEX1,TEX2细胞、驻留记忆CD8+T细胞(TRM)和激活效应或记忆T细胞(TEMRA细胞)，TCR丰富度沿轨迹下降，并且克隆型通常在随后的T细胞表型之间共享（图2b）；RNA速率分析证实了这些轨迹，标记基因的分析证实了它们的功能注释（图2c,d）；无论是治疗前还是治疗后，TEX细胞在Es和NEs的轨迹末端富集更多，在所有轨迹中，Es的TCR丰富度低于NEs，与前处理相比，处理后的下降更明显，反映了抗PD1诱导的T细胞持续扩增（图2e）；对CD4+T细胞进行发育轨迹分析，发现存在2个不同的分化方向，包括TH1和TFH（图2f）；克隆型通常在随后的T细胞表型之间共享，RNA速率分析证实了这些轨迹（图2g,h）；沿轨迹的标记基因和相关转录因子分析证实了它们的功能注释（图2i）；NEs中的TH1和TFH细胞在治疗前和治疗后仍然处于早期的前效应或记忆状态，而Es中它们在轨迹的末端积累，TCR丰富度随着轨迹的结束而减少（图2j）。
图2CD8+和CD4+T细胞扩增轨迹分析
AnalyticalBioSciences
●●●
3.T细胞克隆扩增过程中基因表达的变化
GENEEXPRESSIONCHANGESDURINGTCELLEXPANSION
作者发现了五组沿着CD8+TEX轨迹的差异表达基因(DEGs)，且在每个基因集合中鉴定了几个以前未被识别的T细胞标记基因（图3a）；虽然轨迹分配的细胞在相同的拟时间具有相似的表达，但也观察到一些基因在E和NE轨迹之间有差异表达（图3b）；通路分析显示Es中干扰素(IFN)反应上调，氧化磷酸化下调（图3c,d）；沿着CD4+TH1的轨迹，同样确定了5个基因集（图3e）；与CD8+T细胞相似，NEs中RUNX3和CBFB减少，而Es中IFN-α/γ反应增加（图3f-h）；因此，沿着轨迹的基因表达谱可以识别Es和NEs之间差异表达或激活的标记或通路。
图3CD8+TEX和CD4+TH1轨迹的差异表达基因
AnalyticalBioSciences
●●●
4.T细胞的表达特征预测T细胞的扩增
EXPRESSIONSIGNATURESINTCELLPREDICTTCELLEXPANSION
接下来，作者鉴定了扩增的T细胞与未扩增的T细胞之间的差异基因（图4a）；免疫检查点标记物和CD4+TH1活性在Es和NEs预处理中最能预测T细胞扩增（图4b）；CITE-seq证实NEs中初始T细胞标记物高于Es，而免疫检查点、肿瘤反应和共刺激标记物减少（图4c）；当Es、TNBC(n=5)与ER+BC(n=3)比较时，扩增的克隆型数量没有差异，而预处理后的T细胞中PD1的表达和增殖T细胞的数量在TNBC中更高（图4d,e）；在TNBC中，Es表现出CD8+T细胞效应功能基因、CD4+TH1活性和免疫检查点基因的表达增加（图4f）；分析了在抗PD1之前接受新辅助化疗的患者（队列2）的治疗前和治疗后活检对（n=11），使用与队列1相同的分析策略，将三名患者指定为Es（图4g）；在Es中，T细胞和pDCs在治疗后增加，而治疗前不增加，PD1在治疗前和治疗后均增加（图4h,i）；T细胞亚群分析证实CD4+和CD8+TEX细胞在Es中更常见，无论是治疗前还是治疗后（图4j）。
图4在BC和BC亚型中，增殖T细胞和非增殖T细胞特征
AnalyticalBioSciences
●●●
5.树突状细胞与T细胞扩增相关
DENDRITICCELLSASSOCIATEDWITHTCELLEXPANSION
树突状细胞(DC)在调节CD8+T细胞免疫和肿瘤抗原耐受之间的平衡中起着核心作用,对来自仅接受抗PD1(n=29)治疗的患者的个DC进行聚类，共得到6个亚群（图5a）；与NEs相比，Es致DC中PD-L1(CD)和PD-L2(PDCD1LG2)升高（图5b）；免疫组化实验证实，治疗前和治疗后Es的PD-L1均较高（图5c）；在DC亚型中，PD-L1仅由mregDC表达（图5d）；治疗前的相对DC频率在Es和NEs之间没有差异，除了mregDCs在Es中富集（图5e）；治疗前Es和NEs的DEGs显示出干扰素响应、DC分化、抗原交叉呈递和T细胞共刺激相关基因水平升高（图5f）；在Es组中，pDCs,ASDCs和mregDCs富集频率明显升高（图5g）；作者将个髓系细胞聚类后得到10个亚群，包括两个单核细胞群(C1和C2)和八个巨噬细胞群(C3-C10)（图5h）；在治疗前的巨噬细胞中，Es中PD-L1/L2明显高于NEs，而一些细胞因子(CXCL9,CXCL10,CCL8)和I/II型IFN应答基因上调（图5i）；CITE-seq证实Es与NEs治疗前共刺激标记物的表达增加（图5j）；在细胞亚群水平，大多数巨噬细胞亚群表达PD-L1（图5k）；在Es治疗前，C7_CX3CR1巨噬细胞处于耗竭状态，并在治疗后变得更加明显，而治疗后C3_CCR2巨噬细胞在Es富集（图5l）。
图5表达PD-L1的树突状细胞与T细胞扩增相关
AnalyticalBioSciences
●●●
6.T细胞克隆扩增的肿瘤更容易受PD1治疗的影响
CANCERCELLSAREAFFECTEDBYANTI-PD1INTUMORSWITHTCELLEXPANSION
因为T细胞的活性依赖于癌细胞的肿瘤抗原呈递，作者研究了癌细胞，与治疗前相比，治疗后Es细胞数量减少（图6a）；虽然作者未能在癌细胞中检测到PD-L1，但发现了许多抗原呈递主要组织相容性复合体(MHC)I/II类基因在NEs中下调（图6b,c）；比较Es治疗前和治疗后，证实了正在进行的抗肿瘤免疫反应、细胞增殖、蛋白水解、细胞死亡、免疫信号通路和细胞*性通路富集于Es治疗后的癌细胞中（图6d）；CD4+或CD8+TEX细胞、增殖T细胞、migDCs、表达PD-L1的巨噬细胞表型的相对频率与T细胞的扩增呈正相关，而初始或效应/记忆T细胞与抑制性巨噬细胞呈负相关（图6e）；作者观察到，治疗前Es比NEs有更多的相互作用可能性，特别是在癌细胞、DCs、单核/巨噬细胞和T细胞之间（图6f）；Es中CD8+或CD4+T细胞与其他免疫细胞之间的特异性相互作用，包括共刺激或共抑制相互作用（图6g,h）；
图6交互免疫环境与T细胞扩增正相关
AnalyticalBioSciences
●●●
7.结论和意义
CONCLUSIONSIGNIFICANCE
基于以上结果作者得到了BC患者新辅助抗PD1后T细胞扩增相关的治疗前免疫环境图谱。该资源可以为ICB后临床获益的潜在预测生物标志物提供见解。但需要进行多周期抗PD1联合化疗的后续研究，以确认这些生物标志物与临床反应之间的关联，并进一步探索与抗PD1协同使用的候选蛋白的靶向治疗。
AnalyticalBioSciences
●●●
参考文献：
Bassez,A.,Vos,H.,VanDyck,L.etal.Asingle-cellmapofintratumoralchangesduringanti-PD1treatmentofpatientswithbreastcancer.NatMed27,–().
关于百奥智汇
百奥智汇是一家生命科学技术公司，致力于将单细胞机理研究平台和生物信息学大数据/AI平台充分应用于癌症等重大人类疾病的诊断和治疗。通过创建人类疾病的精准细胞图谱，充分利用自身强大的科研能力、自有平台和数据，百奥智汇将寻找具突破性的疾病诊断和治疗靶标、开发颠覆性的治疗方法。欲了解更多关于百奥智汇的信息或服务，可通过下方的通讯方式联系我们。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇